A Basílica de Nossa Senhora de Guanajuato é a principal catedral da cidade, construída entre 1671 e 1696. Abriga uma estátua de madeira da Virgem adornada com joias que supostamente data do século VII, tornando-a a mais antiga peça de arte cristã do México. A catedral é dedicada à santa padroeira e protetora da cidade. O edifício possui um órgão de tubos barroco francês com 1.098 tubos.