Die Basilika Unserer Lieben Frau von Guanajuato ist die Hauptkathedrale der Stadt, erbaut zwischen 1671 und 1696. Sie beherbergt eine juwelenbesetzte Holzstatue der Jungfrau, die angeblich aus dem 7. Jahrhundert stammt und damit das älteste Stück christlicher Kunst in Mexiko ist. Die Kathedrale ist der Schutzpatronin der Stadt gewidmet. Das Gebäude verfügt über eine französische Barockpfeifenorgel mit 1.098 Pfeifen